Ce tableau nous parle de la généalogie de Jésus. Au XV^ème siècle, Jésus est présenté comme est issu d'une lignée noble, celle du roi David. Dans les œuvres d'art religieuses, les membres de la sainte famille, sont richement vêtus. Durant cette période, le dogme de l'Immaculée Conception — selon lequel Marie a été conçue exempte du péché originel — est en plein développement. Ce miracle implique que la mère de Marie, Anne, gagne en importance. Le culte de la sainte Anne trinitaire (Sainte Anne présentée avec sa fille Marie et son petit fils Jésus) est introduit et de nombreux artistes réalisent des tableaux sur ce thème.

En 1481, le pape Sixte IV fait ajouter la fête solennelle de sainte Anne au calendrier de l'Église romaine, le 26 juillet. En 1494 le pape Alexandre VI favorise le culte de sainte Anne par la mise en place d'une indulgence qui promet la remise des péchés à quiconque prononce une prière devant l'image de Anna metterza (sainte Anne, la Vierge et l'Enfant).

Voici quelques exemples de tableaux représentant des Sainte-Anne trinitaires :

L'observation attentive de ce tableau et de ses copies a révélé une grande quantité de dessins cachés, si bien intégrés dans l'image, qu'on ne les détecte quasiment pas au premier regard. Dès le carton préparatoire, l'idée d'intégrer ces éléments graphiques est bien présente. On repère des visages de personnages dans le décor autour de Sainte Anne. On les retrouve dans les premières couches du tableau du Louvre sur l'image infrarouge et dans les copies de F. Melzi et du Hammer Museum. Léonard ne se contente pas de faire une représentation classique de Saint Anne, la Vierge et l'enfant. Il veut évoquer une généalogie plus large de l'enfant Jésus, comme le font les tableaux représentant l'arbre de Jessé ou ceux d'Europe du nord. Il ajoute les membres de la sainte famille, subtilement cachés dans le décor ainsi qu'un arbre symbolisant celui de Jessé.

En plus du thème de la généalogie, il ajoute de multiples symboles généralement sous forme de têtes d'animaux. Dans les montagnes on trouve des visages qui regardent le ciel comme des âmes de pécheurs en attente de rédemption. La plus haute montagne t à droite de Sainte Anne est comme un vecteur de communication avec Dieu. De part et d'autre de ce magnifique paysage minéral et bleuté, des arbres aux allures menaçantes et quelques chauves souris, nous rappellent que la vie terrestre n'est pas un paradis. En milieu de tableau, on trouve un perroquet montrant la richesse de cette famille de sang royal, un phœnix symbole d'immortalité, un poisson qui évoque le christianisme et un taureau symbole de fertilité. Dans la partie basse se concentrent les animaux symbolisant les démons comme le crapaud, le singe et le serpent.

Les copies de F. Melzi (son plus proche collaborateur avec Salaï) et du Hammer Museum pourraient avoir été réalisées du vivant de Léonard. En tout cas leurs auteurs avaient une connaissance assez fine des symboles cachés par Léonard, dont ils ont reproduit les principaux. Il ne s'agit pas pour autant de copies fidèles. Ils ont fait preuve d'originalité dans le traitement du paysage et la disposition des personnages cachés.

Comme on a pu l'observer dans quasiment toutes ses œuvres (même les dessins de ses carnets), Léonard aime jouer, de toute évidence, à intégrer ces symboles graphiques. Il utilise systématiquement des têtes d'animaux pour enrichir le contenu symbolique de ses œuvres. S'agit-il d'un défit technique ? Veut-il créer une sorte d'énigme graphique, un jeu d'observation, que seuls les initiés (probablement d'autres peintres) sauront décoder ? En tout cas c'est de toute évidence une marque de fabrique.